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细胞培养操作流程

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       细胞培养是从生物体中取出细胞。将其在合适的人工环境中生长、扩增、繁殖,收集的过程。细胞培养的优点是首先细胞是一个活性系统,相比于化学合成方法,更具有生物活性。同时它也具有可控制性,选择特定的细胞种类进行特定性质的细胞进行培养,同时这些细胞来源于同一个组织同一种细胞,因些样品具有均一性,适用于规模化生产。
        从体内取出的第一次培养称为原代培养,将这些细胞按比例稀释后重新接种到另外一个培养基中进行再培养过程就称为传代培养也称为再培养。而这些经过原代培养后可以继续进行传代的细胞称为细胞系,我们常常将细胞系分为无限细胞系和有限细胞系。
        细胞培养环境要求,由于体外培养的细胞是没有抗感染能力的,因此防止细胞污染是决定培养成功的首在条件,一切培养过程中的操作都需要保证无菌和安全,这里的无菌指对细胞生长而言我们要保证无菌的环境,而安全则是对我们操作人员而言也是要把安全放在第一位的。
        细胞的体外生长环境要模拟体内过程,在体外失去了机体的调节和控制,因此除了满足基本的营养要求以外,还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境,外环境的培养条件包括温度、气体环境、渗透压这些都会影响细胞的生长,一般我们会通过细胞培养箱进行控制,在调控这些条件时,一般会控制细胞培养箱的温度维持在37℃,因为哺乳动物及人源细胞的最适培养温度基本都在37℃,而细胞二氧化碳的浓度会调节在5%左右,就是为了维持培养基的溶解的二氧化碳以及碳酸氢盐的平衡,从而使得培养期维持一个稳定pH状态。一般细胞培养的最佳pH值在7.2-7.4。环境温度一般控制在95%,为防止培养基的快速蒸发,进入培养环境的空气要经过除菌处理。保证培养环境无菌。
        无菌操作环境,通常我们会选用超净工作台或生物安全柜来进行细胞培养的操作,在生物安全柜中一般会建议分为三个区,洁净区、缓冲区/操作区、废液区,区域的有效划分对我们细胞操作过程中可以控制比较好的无菌环境,超净工作台/生物安全柜在每次使用前要进行消毒剂(75%)酒精擦拭,然后用紫外线照射20-30分钟,细胞培养间建议也是需要定期进行消毒。紫外照射过程中不要对物品过多的重叠放置,那样会影响紫外消毒效果。当制定好实验计划后要将所需器材和物品清点无误后将其放置在操作场所,然后开启紫外灯,避免物品不全,而反复拿取物品增加污染机会。
       细胞传代培养过程,根据细胞系的生长情况,生长特点可能把细胞分为悬浮细胞(悬浮在培养基中进行生长)和贴壁细胞(贴在培养器皿的底部生长)。
        以我曾经培养过的贴壁细胞为例,介绍一下细胞生长过程,总共可分为六个时期,游离期、贴壁期、潜浮期、对数生长期、停止期,游离期就是刚接种细胞后在培养液中形成的悬浮状态,这个时期的细胞有一个回缩呈球形的状态,随着时间的延长会慢慢的附着到培养皿上,此时游离期结束进入贴壁期,此时细胞也处于潜伏期,随着时间延长,细胞数量成倍增长,这个时期就称为对数生长期,此时细胞的活力是最好的,同时也是适合研究的时期。当细胞生长比较旺盛,长满底部的时候会逐渐影响到细胞的生长,从此细胞进入了停止期。
      为了让细胞维持在一个比较好的密度可以继续增殖,需要细胞进行一个传代培养的过程。根据细胞生长的情况,悬浮细胞和同,贴壁细胞有不同的操作,对于悬浮细胞只要把细胞收集好,进行离心重新放到一个培养皿中就可以,收集程可以用离心法传代或直接传代法。而对于贴壁细胞而言我们需要采用一个酶消化法进行传代,常用的消化注有EDTA-Na2、胰蛋白酶。
        整个传代过程可以分为四步,一、清洗过程,首先吸出原有培养基,用平衡盐溶液(不含钙、镁离子)清洗细胞,再吸出冲洗液。第二步加入消化液,37℃孵育2-5分钟。消化时间和温度根据不同的细胞类型进行选择,有一些细胞相对容易消化可能就在室温消化2分钟就可以,对于那些难以消化的细胞,建议放在37℃消化。第三步终止,当在显微镜下观察细胞的解离程度,同时会发现有些细胞开始变圆,但此时不要等到它完全脱离底部就可以终止消化了,然后将这些细胞收集到离心管中进行第四步,离心重悬,将细胞稀释到合适的密度进行接种就完成了整个细胞传代。
      需要注意的是在使用胰蛋白酶消化过程中,消化时间要适度,因为胰酶本身对细胞生长还是会有损伯伤,同时在收集细胞的时候避免产生过多的气泡,这样也会影响细胞的收集。
       要及时观察并记录整个细胞生长的过程,细胞生长状况包括它的形态、培养基的颜色,细胞的生长过程中有可能遭受一些微生物的污染,这时候如果我们能够采取有效的措施,可以挽救一些细胞,前提是我们及时观察并发现。生长良好的细胞透明度会较好,遮光性比较强,轮廓清晰,当细胞出现生长不良时,遮光性会变弱,同时会发现细胞形态发生变化,要及时排查原因,培养过程中需要投入更多的耐心和关心。
发布于 2022-09-05 13:36:10 © 著作权归作者所有
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