写在前面的话：上上个月跟着刘老师做了一次RNA提取，然后今天在老师的监督下进行练习，过程惨不忍睹，记录一下引以为戒。
RNA提取流程（图片来源于网络，仅供学习交流用）
1.工作液配制
①Buffer RLT 工作液：根据实验用量配置，工作液比例10ml Buffer RLT 中加入100μl巯基乙醇；
错误：巯基乙醇在通风橱里面使用，在外面打开像开了毒气弹。
②Dnase混合液（按照说明标注稀释DNaseⅠ储存液，单个样本需要量——取10μl DNaseⅠ储存液混合70μl Buffer RDD）;
错误1：在Buffer RDD第一次移取时贴壁加液，然后继续移取下一步样品，有污染Buffer RDD的可能；
错误2：混匀时涡旋混匀，与说明书的规定不一致（Mix gently by inverting。DO not vortex），可能会引起Dnase I 变性（denaturation）。
③Buffer RPE工作液（1ml Buffer RPE 加入4ml无水乙醇）
④70%乙醇；
⑤80%乙醇
失误：三次实验均用到无水乙醇，没有先移取无水乙醇然后移取其他液体，整体实验效率降低。
原因：试验前未规划。
2.供试品取样
1)供试品取样应当具有代表性
产品、中间产品产生细胞悬液直接取得供试品细胞。
2)细胞类制品原辅料的的检验数量及检验量
送检供试品细胞检验量不低于2×105细胞数量，注明细胞数量。每个供试品送检验数量以2或3为适。最低送检验数量1。
3)供试品处理及转移
按照细胞培养工艺传代等同条件获得细胞沉淀，使用1.5ml规格无菌离心管转移。短暂存放4℃，冰上转移。长时间存放-80℃冷冻保存，干冰长途转移。
错误：未注意冰上转移，手拿样品。
原因：除没看文件外，还有知识盲区，细胞死亡过程可能会释放各种酶导致RNA被降解，低温将此可能降到最低。其次手很热没注意过。
3.供试品RNA提取
按照以下步骤，提取RNA：
1)RNA提取试剂盒，部分试剂需提前准备工作液；
错误1：按顺序进行溶液配制，未进行规划，其次未考虑使用顺序。
正确操作1：优先配制工作液后制备细胞沉淀。如未及时配制优先配制Buffer RLT 工作液，在完成沉淀制备及时加入Buffer RLT 工作液进行裂解保护目标RNA。
错误2：未正确标记离心管同时及时书写记录。
正确操作2：在记录中根据样品序号写好样品名称，然后在待用管上标记样品序号（如1、2、3....)。注意最终样品要标记名称。
2)RNA提取步骤
细胞沉淀（如为细胞悬液，离心600g,8min,去除上清）加入350μl Buffer RLT 工作液。吹打混匀。
错误1：使用1mL枪头进行吹打，可能会导致RNA被枪头过多吸附。
正确操作1：使用0.2mL枪头吹打减少吸附，吹打时注意避免污染滤芯，少吸轻吹混匀即可。着重对沉淀进行吹打，不必整管混匀，因为后续步骤会有混匀的作用。
错误2：移液枪盒离废液槽过近，容易被污染。
正确操作2：实验现场合理布局，例如分三区，洁净区域、污染区、操作区，其次对每一个区域再进行细分。
实验分区（图片来源于网络，仅供学习交流用）
错误3：贴壁加样，效率低。可以反向吸液悬空加，但需要注意不要交叉污染。
3)将以上样本按照不超过600μl体积每次，过柱子“QIA Shredder”,12000rpm,2min。回收流穿液。
错误：柱子差点用错，试验前未确认，尴了个尬。
4)加入等体积70%乙醇，吹打混匀，转移至纯化柱中，冰上静置2min。离心10000rpm,1min，弃废液。
错误：冰上静置的时候把整个管插到冰里面，冰水有可能进入到收集管中，丢人丢到姥姥家了。
5)加入350μl Buffer RW1, 10000rpm,1min，弃废液。
错误1：弃废液的时候没忍住甩了一下，此处不仅是污染还有安全问题。
错误2：倾倒废液的时候收集管与废液管口对口倾倒，容易导致交叉污染。
6)加入80μl DNase混合液。室温静置15min。加入350μl Buffer RW1, 10000rpm,1min，弃废液。更换新收集管。
错误：忙着聊天，没有加入Buffer RW1就去离心了。无语凝噎。
注意：更换新的收集管如果DNase残留会导致cDNA的降解。
7)加入500μl Buffer RPE工作液，10000rpm,1min，弃废液。
8)加入500μl 80%乙醇，10000rpm,2min，弃废液。更换新收集管。
9)开盖干燥同时进行离心，13000rpm,5min，弃废液。更换新1.5ml收集管。
10)加入18μl无核酸酶水洗脱，静置2min, 13000rpm,1min。
11)吸取收集管中水，重复洗脱步骤⑨。获得提取样本RNA溶液18μl。
错误1：吸取无核酶水的同时打开纯化柱盖，手忙脚乱还可能引入污染。
正确操作1：取出纯化柱，吸取无核酶水后将纯化柱放回然后打开盖子。
错误2：枪头碰触纯化柱的滤膜，可能会导致滤膜破损进而导致洗脱效率降低。
12)标记名称，批号。（负80度保存，备用）
4.小结
作为一个分子生物学的小白，一个QC老油子，充满敬畏却缺少足够的重视，归结起来说确实很不认真。事前没有梳理流程，前一次学习完也没有再复盘。总认为自己有很多细节还不清楚，对理论的理解不够，然后就不想迈出那蹩脚的一步，总想着完美。
我会努力的（图片来源于网络，仅供参考）
接下来要参与细胞治疗产品分析，需要学习了解的还很多，我这个QC老油子需要认真一些。
以后实验需要落实以下几点：
1)试验前进行梳理规划，明确实验流程；
2)试验前了解实验的原理；
3)认真阅读说明书，特别是使用试剂盒的时候；
4)迈出第一步，将理论学习与实践进行拆分，不能互为前提，不懂理论时候可以忠实模仿，懂了原理再复盘；没有实践时可以根据已有经验进行规划设计，学会知识迁移的才是高手。
5)认真对待每一次实验。
6)用脑子：离心机陪平时24个孔3个样品，1、9、17好过隔7个孔放样，我的狗脑子。
最后感谢雷哥，告诉自己：走点心再走点心。
