被收录1次
生产系统其他

qPCR菜鸟学习笔记(一):DNA提取理论学习

支原体qPCR小白,学习DNA提取理论知识和相关化学试剂作用的学习笔记。
阅读 281 收藏 5 赞同 7
手机端查看
使用微信 “扫一扫” 即可在手机上查看
写在前面的话:细胞治疗产品需要进行支原体检查,因药典方法较为漫长且对实验环境要求较多,在硬件条件不具备的研发阶段采用 qPC法进行支原体检查成为了刚需。因为人手有限个人不得不着手于支原体qPCR方法的学习。写一下笔记巩固自己所学同时赚点奶粉钱,欢迎拍砖。
正文
qPCR进行支原体检查分为两个步骤:DNA的提取和DNA的扩增及检查。我们首先分享DNA提取的学习内容。本文主要是理论基础及试剂简介。
核酸提取示意图(图片来源于网络仅供参考)
1 DNA提取纯化的理论
进行试验前明确实验的基本原则和操作原理有助于我们理解实验,能在实验过程中更有预见性,不做一个只会重复的工具人。
1.1DNA提取的基本原则
1.1.1DNA结构的完整性。例如qPCR探针法进行支原体检查的原理是通过扩增支原体基因组中的16SrRNA编码区特异性检测支原体,可在520nm(FAM通道)检测支原体特异性扩增。如支原体DNA不完整即无法特性扩增并检测。

思考:

(1)为保证这一点我们实验过程要做到动作轻柔,不要剧烈吹打避免认为降解DNA。
(2)注意DNAnase的灭活。
(3)如果我们购买的仅是qPCR支原体试剂盒,没有购买配套的提取试剂盒,那么此时我们不仅是要做检测试剂盒的适用性,还需要验证我们提取的有效性。
1.1.2DNA的纯度。尽量排除其他大分子物质对DNA的干扰,以免影响后续实验。保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。

思考:

(1)我们限定细胞样品的细胞总量也有此类考虑,其他大分子物质中非目标DNA都可能影响实验;
(2)特别警告QC:取样不能贪多,作为一个QC如果考虑代表性总期望加大检验量,此时需谨慎;
(3)我们对自己的样品要有了解,如果含有对酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子,我们需要确认实验前是否可以有效去除或者通过细胞培养的方式降低对酶有抑制作用的有机溶剂及金属离子的浓度。
(4)说到干扰其他核酸的分子的污染是常见的干扰因素。特别是人可能携带支原体、支原体阳性标本涡旋时会产生气溶胶等。所以支原体检查时我们需要特别注意在生物安全柜内严格无菌操作,涡旋后最好进行快速离心。
1.2DNA提取的步骤
DNA提取只有两步:裂解和纯化。
1.2.1裂解
裂解是将样品细胞结构破坏,使DNA和其他细胞成分游离在溶液中。DNA裂解的方法有机械作用、化学作用和酶作用。
机械作用常见的有液氮研磨。
化学方法有CTAB和SDS法。CTAB是阳离子去污剂,SDS是阴离子去污剂。它们都可以溶解细胞膜,达到裂解的目的。去污剂使蛋白质变性,对膜结构进行破坏,把与核酸相连接的蛋白质解开。
酶的作用,比如蛋白酶K的消化作用。
思考:
(1)我们细胞治疗产品的检测目标是细胞或细胞上清液,以细胞上清液为主;因此使用酶消化是较为温和简单的方法。
(2)酶的活性受背景环境的影响,特别是温度和盐离子等影响。我们需要对初始样品有一定的了解,避免其中可能含有的有机溶解和高浓度盐离子对实验的影响。或加入缓冲液营造适宜的背景环境。
1.3DNA纯化
纯化是将DNA与其他的细胞成分(比如蛋白、脂质、多糖和RNA等)分离。
裂解完细胞结构,将DNA分离的基本思路就是利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理、化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。比如:
a)DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。用高浓度的盐溶液溶解DNA,能去除在高盐中不能溶解的杂质;用低浓度的盐溶液使DNA析出,能除去溶解于低盐溶液的杂质。
b)大部分蛋白质不能忍受60-80℃高温,而DNA在80℃以上才会变性。
c)DNA不能溶于酒精,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精。
思考:
(1)以上几点对于我们理解后续各种纯化方法的细节很有帮助。
(2)在验证提取纯化有效性不满足要求时,我们需要根据实验原理对其中某一环节进行修改或增加。
1.4常见DNA提取方法
进行支原体的DNA检查,肯定要了解主流支原体检查试剂盒厂家提供的检查方法,常见的方法是磁珠法和沉淀法。至于滤膜法因为成本较高暂不考虑,同时考虑成本个人考虑使用离心柱法。
1.4.1沉淀法
常见支原体测试供应商试剂盒比对(图片来源于网络仅供学习交流用)
沉淀法是经典实验方法,主要的步骤是通过酚/氯仿抽提去除蛋白质,然后使用乙醇/异丙醇沉淀DNA。酚可以从水相中抽提变性的蛋白质,抑制DNAase的降解。氯仿则加速有机相和水相分层,去除残余酚。
思考:
(1)看到氯仿我就莫名的恐惧,不在通风橱里面做是不行了。
(2)看在其可以进行大样本量处理的面子上,我还是特别想试验这种方法。
(3)隐隐有点担心沉淀法会不会沉淀杂质干扰呢,这些需要好好研究一下。
1.4.2离心柱法
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
离心柱法(图片来源于网络仅供参考学习)

思考:

(1)安全性很有保障,就是样本量有点低;
(2)收集管的体积有限限制了操作的空间;
(3)为了保障检出需要对DNA进行浓缩,此时移液体积就更小了。练好移液枪势在必行。
(4)考虑成本临时选择离心柱法。
1.4.3磁珠法
磁珠法的主要步骤可以分为四步:裂解-结合-洗涤-洗脱。具体步骤此处不介绍。
磁珠法示意图(图片来源于网络仅供参考)
磁珠法的细胞裂解液时一种蛋白质变性剂,可使细胞裂解并使与DNA结合的蛋白质变性,DNA有理释放,磁珠可特异性的吸附DNA,通过洗涤,去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质,再因洗脱液解离吸附再磁珠上的DNA,得到纯度和浓度都很高的DNA,用于PCR扩增。
磁珠法是将纳米技术与生物技术结合,磁珠主要是一些具有顺磁性的生物纳米磁珠。磁珠表面包裹一层可以发生离心交换的材料(比如羧基),从而达到吸附核酸的目的。表面的羧基与核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合,纯化的原理是在高盐溶液中与核酸结合,在低盐环境中被洗脱。另外,磁珠在磁场的条件下发生聚集或分散,就不需要离心等人工操作。

思考:

(1)磁珠法的核心是磁珠,但是某些厂家卖的盒子里面磁珠太少,我家大牛要自己建立一个体系,期待我家大牛的成果;
(2)磁力架选择时发现有可视的和不可视的,选择可视的。
1.5DNA纯度鉴定
DNA提取完后,要对纯度、浓度和完整度进行检测。常规的方法有:
1.5.1凝胶电泳
可以通过琼脂糖凝胶结果判断提取的DNA是否有RNA、蛋白质、糖酚或者代谢物质等残留。另外,提取基因组DNA时通过条带是否单一明亮来判断DNA的完整度。凝胶电泳法可以通过片段亮度与DNA marker比较,粗略判断提取的DNA浓度高低。
1.5.2分光光度法
DNA或RNA链上碱基的苯环在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处;蛋白质在280nm处有最大吸收峰,盐和小分子集中在230nm处。利用分光光度计测量浓度的原理是,吸收强度与DNA浓度成正比。检测DNA纯度通常会检测样品的OD260、OD280和OD230值,根据它们的比值来判断DNA的纯度。
通常情况下,纯DNA的OD260/OD280比值大约1.8,大于1.9表明DNA可能存在降解或有RNA污染;小于1.7可能有蛋白残留。通常情况可以先跑琼脂糖凝胶判断DNA的纯度和完整度,然后再借助紫外分光光度计来测量浓度。
1.5.3QBIT检测法
采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光,仪器接收荧光值转化为浓度数据。此方法检测相比于分光光度法更灵敏,更特异,更精确。
思考:
(1)考虑成本,在开发提取方法时1.5.1和1.5.2是我们目前较为便捷的方法;
(2)为了确认提取的有效性,后续还需要添加质控确认提取效果。自己开发方法时需要考虑如选择有效的质控。
2 DNA提取纯化试剂信息简介
也许是为了掌控感,我将可能用到的各种试剂简介进行了汇总。供参考,非原创仅用于交流学习。
2.1蛋白酶K
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高的比活性,是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH值范围(4-12.5)内以及高温(50-70摄氏度)均具有活性。EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。
蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。蛋白酶K能够消化细胞膜和核膜上的各种膜蛋白糖蛋白,同样也能消化和DNA结合的组蛋白。
2.2氯化钠
NaCl有助于去除与DNA结合的蛋白质。通过中和DNA上的负电荷,使分子可以聚集在一起,这也有助于使蛋白质保持溶解在水层中,以使它们不会与DNA一起在醇中沉淀。
当细胞受到低渗或高渗溶液作用时,就会发生渗透作用。盐浓度在细胞裂解中起重要作用。
2.3 EDTA
EDTA螯合二价阳离子,例如Mg 2+和Ca 2+,它们存在于酶中,并降低DNase和RNase的酶活性。例如,DNase酶需要Mg 2+离子作为其活性的辅助因子。用EDTA螯合Mg 2+离子会使DNase酶失去功能,从而保护DNA。核酸与蛋白质的聚集也需要Mg 2+离子。而Ca 2+离子对于细胞壁中间层的固结和膜的稳定性是必需的。
2.4 苯酚
苯酚是一种有机溶剂,因此不可与水混溶,可与氯仿和异戊醇一起用于DNA纯化,以去除蛋白质和多糖污染物。当苯酚与细胞提取物一起摇动时,细胞的非极性成分将在苯酚中分馏,而将极性成分留在水中。DNA不溶于苯酚,因为苯酚是一种非极性溶液。另一方面,由于不同氨基酸的长链,蛋白质中同时存在极性和非极性基团。不同的氨基酸在其侧链上具有不同的基团。同样,蛋白质折叠成二级,三级和四级结构取决于氨基酸的极性。
以25:24:1的比例进行苯酚:氯仿:异戊醇的离心后得到三层,即水相,中间相和底部有机相。在中性至碱性pH值下,核酸带负电且呈极性。因此,它是亲水的并且保留在水相中。在水溶液中,疏水性氨基酸形成保护核。但是,变性后,非极性核(疏水性)会暴露出来,从而导致蛋白质和某些多糖在相间沉淀。
苯酚-氯仿的结合减少了poly(A)和mRNA在有机相中的分配,并减少了在相间不溶性RNA蛋白复合物的形成。苯酚保留了大约10–15%的水相,这导致类似的RNA损失。氯仿可防止水份保留,从而提高产量。
只能使用中性苯酚,因为酸性苯酚会溶解其中的DNA,或者苯酚会通过氧化作用变成醌,并形成自由基并降解核酸。
2.5 氯仿
氯仿一种非极性(疏水)溶剂,非极性蛋白质和脂质在其中溶解,从而促进脂质和细胞碎片向有机相中的分配,使分离的DNA在水相中得到保护。氯仿具有较高的密度(1.47 g / cm 3),可确保两种液体的相分离,并迫使有机相和水相更清晰地分离,从而有助于去除水相,同时最大程度地减少与有机相的交叉污染。由于氯仿本质上是挥发性的,因此它不会阻碍下游过程。
2.6补充:抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?
酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水互不相溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。
2.7异戊醇
三氯甲烷与空气接触并形成有害的气体光气。如果仅使用氯仿,气体截留会产生泡沫或起泡,在萃取过程中会在两相之间起泡沫,使DNA难以正确纯化,此时氯仿与异戊醇或辛醇可以防止溶液的乳化。
2.8核糖核酸酶A
RNase A是一种内切核糖核酸酶,可催化两步反应中5'-酯键处RNA的3',5'-磷酸二酯键的水解。第一步是转磷酸作用,得到终止于嘧啶2',3'-环状磷酸酯的寡核苷酸。第二个是环状磷酸酯的水解以产生末端3'-磷酸酯。因DNA缺少关键的2'-OH,因此无法被RNase A消化。
2.9异丙醇/乙醇
乙醇用于将DNA从提取溶液中沉淀出来,DNA保持溶解在水溶液中,因为DNA具有磷酸二酯主链,其本质上是亲水的。水分子通过形成氢键在DNA周围形成水合壳。异丙醇/乙醇用于沉淀DNA,破坏水合壳。异丙醇是沉淀DNA的好选择。异丙醇的需求量较少(上清液的体积为0.6–0.7体积),因为异丙醇比乙醇具有更高的降低水介电常数的能力,并且还需要大量的盐才能起作用。具有额外的2'OH的RNA保持与水结合的氢比DNA倾向于保持更易溶于水,因此可以选择性地沉淀DNA。异丙醇也可溶解非极性溶剂,例如氯仿,因此也可以去除之前步骤中的杂质。
通常使用冰冷的异丙醇,但许多研究人员表示应在室温下使用,否则也会沉淀多糖。尽管低温下DNA的产量会增加,但它可能会增加杂质。
2.9.1异丙醇
优点:所需体积小且速度快,适用于浓度低,而体积大 DNA 样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子RNA;但对多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置;
缺点:易使盐类(如 NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
2.9.2乙醇
优点:对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸发出去,不影响后续的实验;
缺点:是总体积较大,在适当的盐浓度下,2倍样品体积的95%乙醇可有效沉淀 DNA需在-20度放置较长时间(30分钟-1小时)同样需要70%乙醇洗涤。
2.10乙酸钠/乙酸铵/乙酸钾/氯化钠/氯化锂/氯化钾
盐在提取方案中的作用是中和DNA糖磷酸骨架上的电荷。pH 5.2的乙酸钠通常与乙醇一起用于核酸沉淀。在溶液中,乙酸钠分解成Na +和[CH 3 COO]-。带正电的钠离子可中和核酸糖磷酸骨架上PO 3-上的负电荷,从而减少DNA分子之间的排斥,使DNA分子的亲水性大大降低,因此在水中的溶解度也大大降低。
2.11乙醇
用70%乙醇洗涤DNA沉淀物,以冲洗过量的盐,离心,并丢弃乙醇,将DNA留在沉淀物中。将沉淀物风干或真空干燥。应避免过度干燥,因为DNA会将以后很难溶解
2.12Tris-EDTA(TE)缓冲液/无菌水
在较早的DNA分离方法中,DNA过去需要干燥保存并在需要时进行稀释。如今,对于长期存储,谨慎地将DNA存储在保持其pH值并防止其降解的缓冲液中。TE缓冲液包含Tris(10 mM)和EDTA(1 mM),其中Tris是缓冲成分,EDTA是螯合成分。对于DNA分离,通常将pH设置为7.5-8.5,TE缓冲液的弱碱性也可以防止酸水解的机会,因为酸水解可能进一步破坏水中DNA的稳定性。
TE缓冲液的Tris氨基成分具有保护DNA链在固态和流体溶液中不受辐射损伤的能力。当辐射产生自由基时,它可能会破坏DNA链。因此,在环境温度下的流体溶液中,Tris通过清除羟基自由基起作用。
EDTA的目的是在DNase或RNase作用所必需的溶液中螯合Mg 2+离子,从而保护DNA免受DNase或RNase的侵害。
无菌水可用于短期DNA的存储。如果将TE缓冲液用于DNA的存储,则应使用无菌水进一步稀释以稀释EDTA浓度,以使镁离子可用于PCR期间的聚合酶活性,因为如果随后必须将DNA发送进行测序,则TE中的缓冲液成分会阻碍DNA的扩增。
3.小结
理论学习在前期调研进行方法选择和日常实验出现异常问题解决时异常有效。基础理论主要从书本或相关文章里面摘抄,个人仅是一个小白,如有缪误恳请不吝赐教。
发布于 2022-07-01 13:53:35 © 著作权归作者所有