环境监测是微生物控制的一个重要环节。本文的环境监测微生物指的是“沉降菌、浮游菌和表面微生物”这三个微生物相关的环境检测项目。关于他们的培养条件，相关指导文件有很多差异，且均为推荐、指南、非强制性的性质，所以历来有很多争论。我查阅了一些资料，做一个总结和建议，给需要的朋友一些参考。
环境微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）。当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基( SDA )。但SDA使用较少，且相关文件差异不大，一般可定义为20~25℃培养5~7天。这里我们重点关注采取TSA培养基（作为微生物的“食物”来讲，可视为“通用型”）监测的培养条件。
A、我们对查阅到的法规逐个来做一个了解：
这两个推荐性国标，作为环境监测的基础性文件，被中国药典和GMP指南等广泛引用。环境监测培养基一般选用TSA30℃~35℃培养不少于2天。
通常来说，细菌的培养时间为2~5天，真菌的培养时间为5-7天，特别是在活菌数量较低的时候。当考虑到厌氧菌、嗜热菌、微嗜气菌、营养不足或需要复杂营养的的细菌和真菌时，特定的培养条件和培养时间可能是必要的。在培养期间，应在适当的时间间隔观察培养皿。
网上流传的本文件中文版与英文版差异很大，让人很诧异。起初以为版本不同，在ISO官网求证后，和最后的参考文件来看，我认为应是翻译者“添油加醋”了。本人的解读也仅供参考。所以，有时间的话，还是尽量看一下原版文件。
4.3.2环境监测方法和设备提到：“一旦选定培养基，需确定培养温度和培养时间。通常，需氧菌应在30~35℃培养48~72小时。酵母菌和霉菌数通常在20~25℃, 培养5~7天。”
该指南也应发布了10年，08月27日，药品GMP指南丛书”修订编写启动工作会议在京举行。期待新版本的发布给我们的工作带来新的切实可行的指导。
9205 《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》指出：“环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），培养温度为30~35°C ,时间为3~5 天，如需要，应根据环境污染微生物种群特性选择特定的培养条件和培养时间。”
这段话的大致意思为：“一旦选择了合适的培养基，就需确定培养时间和温度。通常，对于常规微生物生长培养基(如SCDM)，培养温度约为20°-35°，培养时间不少于72小时。当认识到污染微生物生长缓慢时，可以考虑延长培养时间。上面给出的温度范围绝不是绝对的。在典型的生产环境中常见的嗜常温菌和霉菌通常能够在很宽的温度范围内生长。对于许多嗜常温生物来说，能够恢复生产的温度可能跨越20°的范围。在没有确定证据的情况下，微生物学家可以在较低温度和较高温度下培养单个培养皿。首先在较低的温度下培养可能会损害革兰氏阳性球菌的恢复，革兰氏阳性球菌是重要的，因为它们经常与人类有关。”
这里的SCDM和TSA成分基本相同（是不是同一种培养基，本人在考证当中，欢迎知道的朋友留言告知），USP1116指出培养温度约为20°C~35°C，培养时间不少于72小时先在低温下培养可能会影响和人相关的革兰氏阳性球菌的恢复。这是一个重要的争议点。
这里明确给出了培养条件：“环境监测样本应在至少两种温度下进行培养在20至25°C培养3至5天，然后在30至35°C培养2-3天已被证明足以检测出大多数细菌和真菌
这与USP所倡导的先高温培养有所冲突。与USP 1116“通常、不是绝对的”的口吻不同，WHO使用了“在实践中、已被证明”这样的词汇，更有说服力。
（
Comparison of Different Incubation Conditions for Microbiological Environmental Monitoring）We found the highest recovery of total aerobic count from areas with personnel flow using a general microbiological growth medium incubated at 30–35 °C. The highest recovery of moulds was obtained with mycological medium incubated at 20–25 °C. Single-plate strategies (two-temperature incubation or an intermediate incubation temperature of 25–30 °C) also yielded reasonable recovery of total aerobic count and moulds. However, recovery of moulds was found to be highly inefficient at 30–35 °C compared to lower incubation temperatures. This deficiency could not be rectified by subsequent incubation at 20–25 °C.”
Comparison of Different Incubation Conditions for Microbiological Environmental Monitoring）We found the highest recovery of total aerobic count from areas with personnel flow using a general microbiological growth medium incubated at 30–35 °C. The highest recovery of moulds was obtained with mycological medium incubated at 20–25 °C. Single-plate strategies (two-temperature incubation or an intermediate incubation temperature of 25–30 °C) also yielded reasonable recovery of total aerobic count and moulds. However, recovery of moulds was found to be highly inefficient at 30–35 °C compared to lower incubation temperatures. This deficiency could not be rectified by subsequent incubation at 20–25 °C.”文章指出：“在通用微生物培养基上，需氧菌在30-35°C恢复率最高；在霉菌培养基中，霉菌在20-25℃培养的回收率最高。单板策略（两个温度培养或 25-30°C 的中间温度培养）也产生了总需氧菌计数和霉菌的合理恢复。然而，与较低的培养温度相比，发现在 30-35°C 时霉菌的恢复效率非常低。这种缺陷无法通过随后在 20-25°C 下的培养来纠正。”这也和USP 1116所倡导的先高温培养有所冲突。
B、思考和总结：
国内30℃~35℃，培养 3~5 天 。GBT 30℃~35℃ 不少于2天 2010GMP指南 30℃~35℃ 48~72小时 2011中国药典 30℃~35℃ 3~5 天 2020
国际先20℃~25℃培养不少于72h，再30℃~35℃培养不少于72h。ISO ---------℃ 2-5天 2003WHO 20~25°C，3~5天 30~35°C，2-3天 2012USP 先30℃~35℃ 再20℃~25℃ 2017（40）PDA 先20℃~25℃ 再30℃~35℃ 2014
正如ISO14698所描述的那样，培养条件的选择应尽可能使环境微生物得到复苏和生长。这也应该是我们监测方法所追求的。环境微生物多种多样，不同气候地区也会有所不同，没有哪种条件能使所有的环境微生物被都检测到。期待更新的科学技术能够运用到这方面来并得到法规的认可，让我们有更高效、更准确并带来更低风险的方法可以选择。
文中法规及更多“环境监测”法规汇总，点击链接即可查阅：https://www.bopuyun.com/p/115871332491（https://www.bopuyun.com/p/115871332491）
https://www.bopuyun.com/p/115871332491）