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动态显色法微量技术落地时遇到的问题汇总

匆匆忙忙为了国家二级保护动物中国鲎,我们开始开发新的替代方案。因为重组C因子方法作为替代方法,在验证方法等效性等方面我们没有足够信心,我们暂时选择了动态显色法和动态显色法微量技术。现在总结以下在动态显
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匆匆忙忙为了国家二级保护动物中国鲎,我们开始开发新的替代方案。因为重组C因子方法作为替代方法,在验证方法等效性等方面我们没有足够信心,我们暂时选择了动态显色法和动态显色法微量技术。现在总结以下在动态显色法微量技术Udine过程我们遇到的解决的和待解决的问题如下:
1.设备的验收与计量
1.1. 设备计量
1.1.1. 凡事预则立不预则废,在购买酶标仪的时候考虑了计量波长但是没考虑滤光片的检定问题,简单查了一些计量法规都没有明确是否强制检定,因为公司验收设备首先要计量合格,先计量波长了,滤光片的检定后续再说;
1.1.2. 对于设备,生物探针软件还是不是很利于计量,使用设备主机操作键进行操作更高效,日常检验使用软件,计量设备的固有参数可以使用主机;至于设备的显示与实际的一致性可以通过设备确认来实现,暂定此策略,毕竟计量老师急。
1.1.3. 关于温度的计量,因为计量老师来了才了解到是酶标仪,中间沟通存在了不顺畅,勉强使用西探头靠近加热铜板进行了温度确认;后续计划是否可以同PCR仪温度一样计量,待落实。
1.2. 设备3Q验证
1.2.1. 设备方案提前签批确认时发现,厂家提供的方案对计算机化系统相关内容需要补充,特别是相关电脑相关信息;
1.2.2. 设备进行OQ时因为没有数据有些功能无法验证,PQ的部分内容最好提前进行,以便于OQ验证某些功能;
1.2.3. 关于用户权限的访问用户,无力吐槽,只可以修改自己的密码,建议确认时给访问用户审计追踪权限,不然给QA审计人员操作员权限也有点坑;
1.2.4. 因无很好的温度分布确认设备,未对温度分布进行确认,进行细菌内毒素试验均一性实验。
1.2.5. 验证工程师对软件很熟悉但是对我们的文件体系不够熟悉,我们跟着做事的小伙伴,没有及时让工程师对一些附件进行打印和标识,事后自己准备整理,在一定程度上算是亏本了;
1.2.6. 验证时发现厂家赠送的布兰德的分液器还是挺好用的,相较于多通道移液器来说相对来说更为便捷节省鲎试剂;
1.2.7. 验证时发现多支鲎试剂的预混还是容易产生气泡或产生浪费两者之间选择其一,浪费一丢丢就浪费了,0.35ml取出0.3ml或少一点也知足了。
1.2.8. 验证过程中还是有些隐形问题在验证时并未确认:操作员不能修改预设OD值、操作员不能进行样品数据库更改、修改功能的使用的异同等等。
2.生物探针软件的中的哪些坑坑洼洼
2.1. 生物探针作为一个汉化软件还是有一些小坑,我们使用时需要注意;
2.2. 软件的预设OD值修改后并没有保存确认功能,但是软件有个功能就是默认参数是上一次实验的参数,此时一个傻瓜修改方式就是管理员预先运行相关程序;
2.3. 修改功能是可以实现多个相关变量信息的修改的,但是存在一个问题如果将供试品与供试品阳性一起修改会出现样品限值未定义的BUG,还是建议要改一起删除然后添加;
2.4. 修改功能进入后,修改了相关内容,并未显示保存修改,此时需要将鼠标点入其他可编辑文本框保存修改才会亮起,你说贱不贱?
2.5. 样品库的搜索小可爱反应也不是太快,属于检索内容后需要点击样品库才会出现检索项目,回车是无效的。
2.6. 除此搜索坑以外样品库里面的数据只能手动下来不能筛选不能调整格式,200多条编辑的时候想哭,想看下有没有输入重复或错误,只能进入样品采集界面下的样品库进行编辑(此时可以搜索);
2.7. 布局时需注意软件自动计算的时候是根据样品名和批号来分组计算的,需要确保自己的各组信息不能重复,名称和批号一致的样品需要增加更多细节信息如批号加后缀等方式确保可区分;
2.8. 处理结果时需要注意不要随意添加标曲,我们目前每次实验都新建标曲,添加了也没用;
2.9. 趋势分析的功能需要管理员实验前在管理员界面做出趋势分析数据自动添加的功能来实现自动添加;
2.10. 实验结束,未达到预设OD值的样品的测试结果是按照停止时间来计算他的检测值的,在不足60分钟时不建议自动停止;
2.11. 预设的时间60分钟和120分钟之间没有可编辑或预设时间,需要手动停止,手动停止总是让人感觉有点小怪。
2.12. 验证完起草SOP也遇到了一些小BUG,不过不能再吐槽,我怕挨打。
3.干扰试验的相关考量
3.1. 标准曲线的建立,标准曲线到底该做几个点,怎么去拟合?
对于标曲不少于3个点时法规规定的,理论上6个点甚至更多数据时相关系数是更完美的,要做的好一些四个点和五个点个人以为较好的选择。不拘泥于3个点,还是怕以后监管要求高了再来改还是工作量,还不如现在就做好。
关于拟合方式药典说的是线性回归,其他的就暂时不考虑了,法规最大,专家们把他定在药典中肯定有他们的考虑。
4个点还是5个点的考虑,个人倾向于考虑3个因素:我们所用工标的最大标示值、标准曲线的最低浓度值、稀释步骤的可操作性。关于最低浓度值个人倾向于鲎试剂的检测限,此时需要注意如果预设OD值(光密度)较大如0.1,此时最低浓度的细菌内毒素标准溶液可能无法达到预设OD值,此时我们就需要延长测试时间。不建议降低OD值,因为鲎试剂厂家研究比我们多,其次降低后CV(变异系数)值可能会变大。根据检测限,建议梯度等倍稀释,这样可操作性会更好,10倍是一个比较友好的倍数。
3.2. 标准曲线要固定吗?
个人建议固定一个通用的,对于特殊产品特殊处理。标曲一直在变,检验时就不好操作了,虽然说没有哪条法规说了标曲一定一致。从标准曲线的可靠性试验开始我们按照既定方式验收了,如果我们检验时的标曲不同,此时验收鲎试剂的数据参考价值就下降了。干扰试验的标曲和日常测试的不同,数据是边缘值时我们也说不清是啥原因了,调查明白也是劳民伤财,不得已定一条固定的。
3.3. 干扰预实验怎么做?
干扰预实验跟干扰试验区别并不大,个人倾向于干扰试验的时候就做多个浓度。
3.4. 干扰试验各浓度怎么确定?
可以根据凝胶法实验或文献资料等确定不干扰稀释倍数或浓度;
参考凝胶法稀释倍数时需要注意鲎试剂灵敏度不同了,不干扰倍数可能不同;
非不得已不建议使用MVD进行试验;
选择三个浓度进行干扰试验即可,对于没证据标明有干扰作用的可以选择原液的2倍、1/8MVD、1/4MVD等倍数或浓度进行试验,给自己留一些余量好江湖再见。
4.日常检验的考虑
4.1. 鲎试剂使用注意事项
4.1.1. 使用前确认细菌内毒素工作标准品的效价、批号、效期及包装完整性;
4.1.2. 细菌内毒素工作标准品应提前从冰箱取出,确保使用时已恢复至室温;
4.1.3. 按照说明书规定的溶解方法及震荡时间,使用细菌内毒素检查用水溶解并稀释细菌内毒素工作标准品至目标浓度。
4.1.4. 细菌内毒素工作标准品是否需要与鲎试剂配套使用,使用前需进行确认。
4.1.5. 在未经验证的情况下,复溶后的细菌内毒素工作标准品按照厂家提供的贮存条件和时间进行贮存;
4.1.6. 鲎试剂使用时注意避免产生气泡;
4.1.7. 鲎试剂复溶后检验混合后使用;
4.1.8. 鲎试剂复溶后需要5-10分钟内完成使用。
4.2. 工作标准品使用注意事项
4.2.1. 使用前确认鲎试剂的灵敏度、批号、效期以及包装完整性;如试剂粉末出现变色,复溶后难溶或有异常颜色变化,应弃之勿用;
4.2.2. 鲎试剂需恢复至室温再使用,需要复溶的鲎试剂,按照说明书推荐的方法加入规定体积的细菌内毒素检查用水或配套的鲎试剂溶解液;
4.2.3. 鲎试剂复溶后避免震动产生泡沫,建议使用新鲜制备的鲎试剂检验样品(加样时间建议控制在鲎试剂复溶后10min 以内);
4.2.4. 从第一个微孔到加样的最后一个微孔,鲎试剂的加样时间应严格控制在5min以内并记录。
4.3. 移液枪使用注意事项
4.3.1. 需要反吸,此时第一枪反吸,后面都吸一打一也不会产生气泡,是否适宜,个人未验证过;
4.3.2. 分液器使用时,需要注意要用枪头而且需要枪头无热原,直接用分液器枪头有点小难度;
4.3.3. 排枪使用的时候不能更KCA法一样使用8通道,使用4通道就够了,不然鲎试剂浪费严重;
4.3.4. 移液枪的使用练习很重要,非常重要。
4.4. 系统适用性的判断
4.4.1. 阴性对照的反应时间(TNC)大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ);
注:反应时间是指一项反应从插入试管开始计时到反应溶液的光度值达到预设值的时间。透光度值用“%”表示,如95%~90%吸光度值用OD表示,如OD0.02~OD0.1。
4.4.2. 标准曲线的相关系是|r|≥0.980;
4.4.3. 质量控制溶液的回收率R在50.0%~200.0%范围内;
4.4.4. 反应重复管的变异系数(CV)≤10.0%。
4.4.5. 对于样品并未将供试品阳性对照溶液列入方法适用性,因为供阳是样品是否干扰的反应,跟系统的适用性无关。
4.4.6. 需要注意手动停止有可能会引起CV不合格的情况出现,对于接近预设OD的低浓度溶液容易手动停止时导致异常。
4.5. 质量控制溶液
4.5.1. 该溶液与已知浓度一致是一个较好的选择;
4.5.2. 该溶液浓度不能过低,如果是标准曲线浓度最低点一样,会出现因为细菌内毒素检查用水本身存在的影响或操作的影响导致其回收率出现异常;
4.5.3. 建议其跟待检测的溶液的理论最大内毒素含量相近。
罗里吧嗦将现阶段的问题进行以上总结,后续需要再添加,因为软件研究、理论研究和实践都是有限的,有错误欢迎批评指正。
发布于 2021-07-30 14:40:40 © 著作权归作者所有
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