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在进行组织培养的实验中,这些潜在的污染来源要注意!

在进行组织培养的实验中,这些潜在的污染来源要注意!
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污染的来源
对于组织培养的新手来说,保持无菌依然是非常大的挑战之一。在早期培训期间,生疏可以通过练习来克服,但是,在某些情况下,即使最有经验的工作者也要面对污染的困扰。潜在的污染来源有许多种,包括溶液、玻璃器皿和移液管的灭菌程序出错;室内空气中的气流和粒子(灰尘和孢子)培养箱和电冰箱维护差;有问题的生物安全柜;引入已经被污染的细胞系或者活体组织;无菌操作上的失误。其中第6个来源很可能是最为重要的。
01
操作者的技术
如果试剂是无菌的并且仪器按照适当的操作规程运行,那么污染则取决于操作者的操作和坏境条件的相互作用。如果操作者技术水平很高、操作严谨并且环境洁净无尘、不受干扰,则污染基本不会由于操作的问题而出现。环境恶化(如建筑工程或者季节性的湿度增加或者操作员技术水平下降(遗漏一个或多个似乎不必要的预防措施)导致污染的概率增加,假如这些同时或者连续发生,那结果可能是灾难性的。
在进行组织培养的实验中,这些潜在的污染来源要注意!
如曲线图所示,让我们设想一下这些事件的综合作用1.1)。保持良好的操作可以由上面的曲线来表示,其中偶尔的失误显示为ー个向下的峰;环境的品质则由下面的曲线描述,不规律的偶尔出现风险增加,例如,被污染的培养皿意外地在环境中打开或者仪器维护时产生灰尘,显示为一个向上的峰。假如两条曲线(好的操作和高质量的环境)保持良好的分离状态,技术失误和环境失衡就很少同时发生。然而,假如技术或者环境方面出现连续的失误,污染的频率将会增加;假如两个条件都恶化,污染将会变得经常而广泛。
02
环境
很明显,进行组织培养的环境必须尽可能干净,并且远离干扰和来往通道。应该避免在常规实验室区域进行组织培养;在普通实验室复杂环境中,生物安全柜并不能给予充分的防护。应指定一个洁净、远离通道的区域,最好是一个独立的房间或者套间。从仓库搬入无菌区的设备,以及门、冰箱、离心机和操作者移动造成的气流都增加了污染的风险。严格遵守表面和仪器的清洁程序,用灭菌抹布擦净所有引入的物品。
03
生物安全柜的使用和维护
最常见的技术不足的范例是不正确地使用生物安全柜。假如工作环境由于瓶子和设备而过度拥挤,层流被干扰,就失去了操作者和房间之间的保护边界层,继而导致有菌的空气进入生物安全柜,释放潜在的生物毒害的物质进入房间;此外,会增加无菌移液管和瓶子或其他物品有菌表面之间接触的风险。仅当物品直接参与当前操作时,才可被带入生物安全柜。
生物安全柜必须由有资质的工程师定期维护,且每年至少两次检查过滤器、管道系统和外壳的完整性。工程师也应该检査工作区的封闭度,确保内部空气没有散出、外部空气没有进入,而这些都依赖于内部的气流速度和外部的湍流。
04
湿度恒温箱
污染的一个主要来源是湿度恒温箱。除非使用开放的容器,否则并不需要高湿度;密闭的培养瓶最好使用干燥恒温箱或者温室。可以采用低培养基(如基于 Hanks盐溶液),以避免培养瓶对CO₂气体交换的需要。如果需要进行CO₂气体交换,最好通过气缸或气管供给,培养瓶密封并置于普通恒温箱中(尽管它们需要在大约30min后短暂排气)。使用透气瓶盖最小化了污染风险,但是与干燥恒温箱比,仍然使培养瓶暴露于风险较高的空气中。如果拧松瓶盖或透气瓶盖的培养瓶持续放在CO₂恒温箱内,尽可能保持恒温箱干燥,并且使用不同的恒温箱培养开放的培养板。如果恒温箱干燥使用,CO₂监控系统需要重新校准,并且要确认培养瓶内液体的蒸发状况;最好在pH平衡后拧紧瓶盖。
然而,在很多情况下必须使用湿度恒温箱。选择一个带有可以很容易直接清洁的内胆的恒温箱可以减少污染的风险。应每周更换保湿托盘内的逆渗透或去离子水[请勿使用超纯水(UPW)]。恒温箱内的培养物可以隔离在一个料盒内,但是pH和温度的平衡需要更长的时间。CO₂恒温箱内的循环风机可以缩短CO₂和温度的恢复时间,而代价是增加了污染的风险;开放培养最好维持在静止的大气中,并且将访问频率尽可能降至最低。对密封培养瓶使用干燥的非CO₂恒温箱,缩短如胰蛋白酶消化等操作程序,可以帮助减少开启用于开放培养和克隆的恒温箱。
05
冷藏库
如果没有定期清洁,冰箱和冷藏室可能会成为污染的主要来源。如果发生了污染,特别是真菌污染,且累及了多人的样本,那么很可能是该污染源导致的。从冷藏库内拿出的任何物品在放入生物安全柜前需用乙醇擦拭,并且冷藏室和冰箱的清洁管理规定应被严格落实。
06
无菌材料
假如在内部或者供应商有适当的质量控制被执行,应该没有源于无菌培养瓶和试剂的污染风险。然而,也会有灭菌失败的状况出现,例如,灭菌包装得太紧,灭菌烘箱或者高压灭菌锅存在冷点,包装在储存前或储存中被戳破,或者一个低级别的污染没有被质量控制检测到。遵循正确的程序,确保所有包装被正确密封,并且通过在包裹中间统一容器内的探针监控所有灭菌包。
当新同事进入组织培养实验室时,让他们熟悉灭菌程序是非常重要的,即使他们并不直接参与这些程序,也应该知道无菌和非无菌物品的位置及区别。一名新成员的一个小错误可能引起严重的问题,在被发现前会持续很多天。
07
引入的细胞系和活组织
由于进入组织培养实验室的细胞系和组织样本可能是污染的,它们应该被隔离,直到可被认为不存在污染后,它们或其衍生物才可以和其他材料一起常规使用。在任何可能的情况下,所有细胞系应该通过一个可信赖的细胞库获得,这样就已经进行了污染筛查。任何其他来源的细胞系,以及所有动物或人类供者来源的活组织,在被排除污染前应该被视为污染。
08
隔离
任何有污染嫌疑的培养物、任何未经检测的引入材料都应该被隔离。理想状况下,隔离应该在一间有生物安全柜和孵箱的单独房间进行,如果条件不允许,可能要征用一个常用生物安全柜。在这种情况下,该生物安全柜应该是一天中最后使用的物品,并且在使用后用含%酚消毒剂的70%乙醇喷淋和擦拭(咨询你们的安全专员;这一操作可能需要风险评估),并在当天停止使用该生物的安全柜。
发布于 2021-06-30 16:48:58 © 著作权归作者所有
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