中国鲎成为了国家二级保护动物，鲎试剂成为了紧俏资源。作为一个注射剂制药企业的QC，不得不考虑以后怎么来应对，除了采用减少鲎试剂的用量外，可选择重组鲎试剂或采用重组C因子法，但结果的等效性研究这个拦路虎很难打到。百无聊赖就翻开了《中国药典检测分析指南》2017年版的热原检查法，开卷有益，该版指南对人员检查的基本原理等进行了全面的阐述，现将学习内容进行总结。
1热原相关的定义及来源
1.1相关定义
热原是注射进入人体或动物体内后，能导致其体温升高的一类物质的总称。可以直接导致体温升高的物质称为外源性热原，由外源性热原引起体内产生的致热物质称为内源性热原。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）。当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素。
LPS是高分子量的脂多糖。
思考:以上定义解释了注射剂为什么要进行热原检查或细菌内毒素检查。
1.2热原的致热原理
外源性物质进入人体，作用到单核细胞系统，刺激其分泌内源性致热原[主要有白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）干扰素（INF）及肿瘤坏死因子（TNF）等]；内源性致热原作用于下丘脑提问调节中枢，使体温调定点上调，造成产热增加、散热减少，导致人体发热。
思考：干扰素、抗肿瘤药物等是否会影响热原的检查？
1.3外源性热原的来源
1.3.1外源性热原中微生物来源的包括：
a)革兰氏阳性菌细菌成分（脂阿拉伯甘露聚糖、蛋白、热休克蛋白A、脂磷壁酸等）；
b)革兰氏阴性菌细菌成分（脂质A、外膜蛋白、膜孔蛋白、陪伴蛋白等）；
c)革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞壁成分（细胞表面蛋白、菌毛、脂肽、脂蛋白、肽聚糖、胞壁酰二肽等）；
d)革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞外成分（毒素、超抗原等）；
e)非细胞性微生物（活病毒、真菌、酵母、疟原虫等）。
微生物产生的致热物质中，革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素致热性最强，其次是革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌致热作用较弱，真菌、病毒致热作用更弱，因此，细菌内毒素被认为是自然界最强致热原。
思考：
a) 注射剂中可能存在的外源性热原主要来自于革兰氏阴性菌死亡或自溶后释放的内毒素。
b) 其他微生物的污染仍需关注，特别是最终灭菌产品的注射液灭菌前负载高且存在较多革兰氏阳性杆菌污染时。
c) 热原检查法相对于细菌内毒素检查法仍有一定优势，单核细胞激活实验等新方法的开发也许会给热原检查法带来新的活力。
1.3.2外源性热原中非微生物来源包括：
a)抗原（人血清白蛋白、球蛋白等）；
b)抗肿瘤药（博来霉素、阿糖胞苷等）；
c)其他（胆酸、多肽、多核苷、秋水仙碱等）。
思考：对于含有以上成分的产品使用热原检查法可能不适用。
1.4内源性热原来源
a)内源性热原中激素类包括：类固醇、前列腺素；
b)内源性热原中细胞因子类的包括：肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子等。
1.5注射剂的热原来源
1.5.1从溶媒中带入
如注射用水贮藏时间过久，被细菌污染后，细菌很快繁殖，短时间内可产生大量热原，虽然随后还有灭菌操作，但是已有热原存在，不易除去，且可能因为革兰氏阴性菌产生更多的内毒素，因而产生热原反应。我们需要对注射剂的溶媒进行细菌内毒素的检查，同时需要进行微生物限度检查。
1.5.2从原辅料中带入
原辅料被热原污染的原因很多，如包装不符合要求或贮存日久，以及许多原辅料本身适于微生物生长。因此我们需要对注射剂的原辅料进行细菌内毒素的检查，同时需要进行微生物限度检查。注射剂一致性评价开展以后强调QBD理念，研发部门或企业进行注射剂仿制药研发时需要根据工艺确定原辅料的内毒素限值。
1.5.3从用具或容器中带入
配制注射剂的装置、用具、管道及容器，如没有洗净或灭菌，都容易污染热原。故应按规定严格处理，并用无热原的注射用水反复冲洗合格后再用。对于这些设施设备的细菌内毒素的控制我们是通过清洁消毒等操作来完成的，为确保这些清洁消毒工作的有效性，我们需要进行清洁验证，在清洁验证过程中进行细菌内毒素检查。
1.5.4在制备过程中污染
注射剂的整个制备过程要在规定的洁净环境中按既定的工艺进行，尽可能减少微生物污染的机会。为确认我们工艺对细菌内毒素控制的有效性，我们需要在工艺验证时对中间产品及成品进行细菌内毒素检查。
1.5.5由于包装不严密产生热原
在制备注射剂时，如果包装材料未经严格挑选，如玻璃瓶底或颈间有微细的孔隙，瓶口边缘不完整，橡胶塞质量不好等，都可使注射液瓶有漏气现象而滋生细菌，产生热原；其次直接接触药品的内包材本身可能产生污染。对于直接接触药品的内包材我们需要进行细菌内毒素的检查，其次进行包装密封性的研究，此处不扩展。
1.5.6从输液器中带入
有时注射剂本身虽不含热原，但注射后却有热原反应，这很可能是由于输液用具污染了热原。在我们产品产品被投诉出现热原反应时我们需要注意配套使用的输液器信息，研发过程如能在起点研究更好，考虑研发效率及性价比，目前初期研究较少。
1.5.7在注射过程中带入
加药时污染：①在输液中加入其他药物时，如所加药物本身已污染热原；②加药时操作室的洁净度差，消毒及操作不严密；③加药后放置时间长。据反映某些医院个别病区有上午加药，下午输液的现象，这在常年室温较高的南方地区是非常危险的。○4注射过程输液瓶等外包装破损，输液瓶近底部有一碰撞造成的微小裂痕而致输液漏气污染，护士在给病人用药时未经认真检查而导致热原反应。
注射剂的使用过程我们能够介入投入的有限，我们可以明确我们注射剂的使用注意事项，在说明书中做好提示说明。
1.6引致热原反应的其他因素
1.6.1与季节(如春夏季节，气温、湿度适合细菌生长)及病人的体质及疾病的危重程度有关。一定量的热原质对不同病人可能会产生不同反应，临床上体质弱和自身过敏体质病人热原反应较多。
1.6.2与输液速度有关：对输液速度监护不够，其结果不仅影响药物疗效，还会产生致热、过敏、恶心呕吐和药物毒副作用增强等不良反应，而且可能导致肺水肿、心衰、昏迷等严重并发症。
1.6.3热原反应还与机体的内环境有关：如神经抑制型(包括病理状态下的抑制)，对热原相对的不敏感；热原对处在兴奋状态下的机体(特别是致病因子引起的兴奋)，较为敏感。
1.6.4输液的温度：因临床应用输液的剂量较大，所以输液的温度以接近人体体温为宜。
1.6.5输液中的微粒也可引起过敏反应、热原反应。
2热原检查法特点
家兔与人体对热原的反应有较高程度的相似性。以家兔给药后3小时内体温升高为指标，能够快速反应外源性热原引起哺乳动物复杂升温的反应过程，不仅能考察细菌内毒素所致发热反应，而且能考察由于其他微生物和杂质引起的发热反应，可用于评价药品中总的致热物质。
热原检查首先应对供试品进行适用性研究，求得其不影响家兔正常体温、无毒性反应、无解热作用的剂量。
思考：
a) 热原检查法可以检查总的致热物质，但是如果供试品本身影响家兔正常体温、对家兔有毒性反应或其有解热作用会限制热原检查法的使用。
b) 热原检查法如果还是家兔法，还是很难使用，建立动物实验室的投入及成本，相对于细菌内毒素检查法还是有点高。
3问题小结
3.1为什么进行热原检查或细菌内毒素检查
由于热原广泛存在于自来水、灰尘、药品生产用管道和器皿中，所以难以彻底排除化学合成药品污染热原的可能性，而以脏器组织为原料制成的生物药品和用微生物发酵工艺提取的抗生素则更容易受到热原污染。
3.2细菌内毒素检查法及热原检查法怎么选择？
细菌内毒素检查法与热原法同为注射剂中致热物质检查法。前法为体外法，检测的致热原仅为细菌内毒素。经实验证明对鲎试剂反应无干扰的药物，以及某些影响家兔正常生理尤其是体温的药物可选择细菌内毒素检查法。由于某些要去的pH值、所含成分、所用溶媒及辅料（如表面活性剂、抗氧剂等）等干扰鲎试剂的反应，所以至今细菌内毒素检查法尚无法完全取代家兔法。
热原检查法主要适用于对细菌内毒素检查法有严重干扰，且无法消除的某些化学药注射剂，以及干扰成分复杂多变、可能污染内毒素意外致热原的品种（如中药注射剂）。
静脉用注射剂，均应设热原（或细菌内毒素检查项）。椎管内、腹腔、眼内等特殊途径的注射剂，一般应设热原（或细菌内毒素）检查项。其中，化学药品注射剂通常首选细菌内毒素检查项；中药注射剂一般首选热原检查项，当中药注射剂本身具有的药理作用或其对家兔的毒性反应影响热原检测、并且该注射液不干扰鲎试剂的反应时，可选择细菌内毒素检查项；生物制品、注射剂用辅料可以根据品种适用性研究结果，选择设置细菌内毒素或热原检查项目。
