最近在忙于新人的培训，发现计算是新人学习内毒素的一个难点，现将个人相关经验进行总结梳理。
1内毒素限值的计算
1.1药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：
L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位）表示；
K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/（kg*h）;放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg*h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg*h);
M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg*h)、mg/(kg*h)或U/(kg*h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
1.2计算经验分享
1.2.1M值确认注意事项
在L值确定时，K值可以根据剂型等信息确认，M值得确认是内毒素限值确认中的难点。
Ø 确认M值，首先要获得剂量信息需要确认说明书中关于用法用量项下的描述来根据用药剂量来推算最大供试品剂量；如果是仿制药注意跟原研药的一致性，不要随意自己随便更改（L值可以直接引用或更严格）；
Ø 对于肌肉注射的制剂，因注射时间不足1小时，按1小时计算；
Ø 一种药物可能针对不同的人群，此时需要关注特殊人群的用药，确保所得M值为各种人群使用中最大供试品剂量；
Ø 对于用法用量项下说明最大供试品剂量的，便不需要再研究针对不同人群的用药方式，直接引用即可；
Ø 对于口服描述如2~4次等关于给药次数的描述时，选择最少次数2次，因为此时剂量最大；
Ø 同一种药物针对不同疾病时可能存在不同给药方式，此时关注“总量不得超过几g分几次给药”等字眼，此时即为最大剂量。
1.2.2原辅料的内毒素限值的计算
随着注射剂一致性评价的展开，因为活性炭退出注射剂的历史舞台，原辅料的内毒素限值控制就成为了势在必行的事情。制剂可以按照公式来计算，原辅料限值如何确定呢？个人有以下思考：
Ø 对于原辅料可以根据处方来推算其内毒素限值；
Ø 可以参考供应商的控制限值；
Ø 仿制药可以参考原研制剂的控制标准；
Ø 如物料性质允许，条件具备注射剂辅料L值可定为5EU/g，这是一个比较省事的策略（需要注意成本，包括检验成本，越严苛检验成本越高）；
Ø 对于注射剂，注射用水占比大，在控制其他原辅料无法满足需求时可以考虑优化注射用水制备工艺将其限值为0.25EU/ml内控为0.125EU/ml；
Ø 对于强酸强碱可以不评估控制内毒素，因为其会引起内毒素降解；
Ø 控制原辅料内毒素后需要与供应商达成一致，确保供应商可以满足我方需求，最好将共识落实到质量协议中；
Ø 对于只能进行热原测试的原辅料，如果要计算其内毒素相当量，可以参考《中国药典检测分析指南》中热原检查法部分原理表述部分内容。
Ø 如生产工艺存在除热源工艺，可以根据实际放宽标准。
2确定最大有效稀释倍数（MVD)的计算
2.1计算公式
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测D用以下公式来确定MVD:
MVD=cL/λ
式中L为供试品的细菌内毒素限值；
c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml,当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。
如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
2.2个人思考
Ø MVD计算不为整数时，如5/0.03≈166.67此时进行预干扰试验时，为了计算方便，最大稀释倍数可以取整数166或160，为了确保检验结果符合规定，不可进舍选择167；
Ø 对于MVD为除不尽无限循环的数字时情况，可以根据MVD推到过程确认第一次稀释的倍数，如5/0.03，即500/3=5/3*100,即首次稀释的总体积为5，供试品取样量为3，再连续稀释2次（每次10倍）即可得到MVD（仅供娱乐，给较真的人参考）,如过程中需要2倍MVD，先稀释10倍再5倍即可。
Ø 凝胶法日常测试时不建议检验MVD，建议检验不干扰浓度和根据安全边际制定的适宜浓度。
3样品稀释过程中的加液量计算
3.1样品稀释过程中加液量的计算
假设初始溶液为S0,取Xml溶液稀释（N）倍至S1，稀释液加液量为Yml，则满足Y=(N-1)X
在N为整数或可整除的分数时直接根据更是计算即可；
当N为不可整除的分数时可以参考MVD计算中的建议，确认N计算来源，将分子与分母（分子和分母要互素，否则继续约分）均乘以分母得到整数Y。如5/3倍，Y=2/3X，当X=3Z时Y=2Z，即可确定Y与X。
3.2稀释过程中的浓度计算
如按照浓度计算时有两种思路可以满足计算需要：
Ø 得到初始浓度后，按稀释倍数进行计算，即按照3.1计算即可；
Ø 假设溶液S0浓度为C0，取V1体积溶液稀释至浓度为C1的S1溶液，稀释液加液量为V2。根据物质守恒原则可知：C0*V1=C1*（V1+V2）
即（C0-C1）V1=C1V2，则V1/V2=C1/(C0-C1)（到此换算为比例关系即可）
则V2=（C0-C1）/C1*V1（不建议换算到这一步）。
以上为个人对于内毒素计算的考量，欢迎批评指正。
